Apostila 3 Patologia clinica

MÉTODOS EM PATOLOGIA

EXAMES CITOLÓGICOS

Importante meio de diagnóstico de doenças, sobretudo malignas e suas lesões precursoras.

Obtenção de material biológico:

Raspados: pele e mucosas;

· Secreções: árvore traqueobrônquica, conteúdo de cistos, expressão mamilar, TGI

· Líquidos: urina, liquido cérebro espinhal e amniótico etc.

· Punção aspirativa: punção supra púbica.

Cuidados com as amostras:

As amostras de células devem ser fixadas em álcool em diferentes concentrações.

Nos exames colpo citológicos as células devem ser fixadas antes de secarem.

Secreções ricas em muco e proteínas podem ser guardadas por até 1 dia.

O resultado do exame é fornecido em termos de diagnóstico morfológico das células. Para expressão de os resultados emprega-se a classificação proposta por PAPANICOLAU:

CLASSE 0: material inadequado ou insuficiente. Fazer nova coleta

CLASSE I: ausência de alterações citológicas. Esfregaço normal

CLASSEII: presença de atipias celulares porem n associadas à malignidade

CLASSE III: esfregaço duvidoso para malignidade

CLASSE IV: esfregaço sugestivo mas n conclusivo p/ malignidade

CLASSE V: esfregaço sugestivo para malignidade

EXAMES ANTOMOPATOLÓGICOS

Biópsia ablastivas ou excisionais => extirpação ou excisionais

O material obtido deve ser bem representativo deve conter a margem de transição entre a úlcera, tecida adjacentes e subjacente.

Biópsia superficial contém apenas material necrótico inflamatório e não mostra lesões graves adjacentes. Ex.: Carcinoma prostático

ANÁLISE MORFOLÓGICA

É feito uma dessecação, em seguida os fragmentos são desidratados, incluídos em parafinas, cortados em micrótomo e corados em HE ou outra coloração histoquímica.

Podemos realizar ainda: reações imunocitoquímicas (I. Direta/Indireta); Citometria; Morfometria; Biologia Molecular; PCR

HIPEREMIAS

(gr. Hiper = acima, excesso; haima =sangue)

Definição: É o aumento do fluxo sangue para um determinado órgão ou tecido. São classificadas em ativas e passivas:

ATIVAS

Decorre de vasodilatação arteriolar com aumento do fluxo de sanguíneo para capilares. Deve-se a 2 fatores :

1) Estimulação simpática;

2) Ação de substâncias vasoativas (histamina, serotonina, cininas, PG, metabólitos locais)

H. A. funcionais

Modificações circulatórias adaptativas devido à maior exigência funcional (aumenta oxigenação). Ex.:exercício muscular; digestão.

H. A. patológicas

Decorrente de vários processos mórbidos como inflamações agudas, hipersensibilidade anafilática, irradiações, traumatismos etc.

Características da H. A.

Região avermelhada, temperatura elevada, aumento do volume, por palpação se percebe a pulsação dos pequenos vasos.

PASSIVAS

Também chamada de congestão venosa ou congestão passiva. É decorrente da diminuição da drenagem venosa. Pode ser localizada ou generalizada.

Localizada

Causada por fatores que dificultam o retorno venoso:

1) tromboses,

2) neoplasias,

3) compressão extrínseca por tumores, hematomas, torção vascular,

4) ação da gravidade por insuficiência das válvulas venosas - varizes.

Generalizada

Resulta do aumento sistêmico da pressão venosa geralmente por insuficiência cardíaca. È mais intensa nos pulmões e membros inferiores.

Características da H.P.

O órgão é vermelho escuro (cianótico), aumentado de volume, ao corte é úmido e deixa fluir grande quantidade de sangue suas veias são mais calibrosas apresentando-se dilatadas e cheias de sangue ao microscópio.

Obs.: As H. A. são melhores visualizadas no indivíduo vivo, ao passo que a H. P. é facilmente observada em vida ou pós mor tem.

Distúrbio Da Circulação

INTRODUÇÃO

A circulação sanguínea e a distribuição de líquidos dependem do funcionamento coordenado do coração, dos vasos de grande e médio calibre, e da microcirculação. Também é importante a circulação linfática.

Controle da circulação: neuroendócrino humoral que envolve atividade cardíaca, volemia, osmolaridade do plasma, tônus da parede celular. Devemos considerar também a fluidez sanguínea.

As arteríolas podem aumentar e diminuir seu calibre aumentando ou diminuindo o volume de sangue que chega aos capilares. O retorno de sangue se faz através das vênulas.

A regulação da microcirculação depende de vários fatores:

a) inervação das arteríolas;

b) mediadores químicos (adrenalina, vasopressina, angiotensina II, óxido nítrico, cininas, histamina, PG, LEU, etc.)

ISQUEMIA

(gr. Ischo = reter; liaima = sangue)

Definição: Oligoemia; Anemia parcial.

Causas da Isquemia: Todos os fatores que reduzem o fluxo de são causas de isquemia . Os mais importantes são os que levam a diminuição das artérias e arteríolas.

Dentre eles estão:

a) ATEROSCLEROSE.

b) TROMBOSE,

c) EMBOLIA,

d) ARTERIOSCLEROSE,

e) COMPRESSÃO DOS VASOS POR TUMORES OU HEMATOMAS

f) ESPASMOS ARTERIAIS

CONSEQUÊNCIAS DA ISQUEMIA: Anóxia e Hipóxia.

Suas conseqüências dependem dos seguintes fatores:

a) do tipo de órgão atingido;

b) do momento funcional do órgão;

c) do estado da circulação; da capacidade do sangue em transportar oxigênio;

Tromboses

( gr. Thrombos = massa coagulada )

Definição: É a solidificação do sangue dentro dos vasos ou do coração no indivíduo vivo.

É uma massa formada pelo processo de trombose e constituída pêlos elementos do sangue coagulado.

É um importante fator de morbidade e mortalidade (grande parte dos infartos do miocárdio e cerebrais se deve a trombose).

Sedes: Qualquer setor do sistema circulatório, mas principalmente veias de membros inferiores e coração.

Constituição dos trombos

Brancos: constituídos basicamente de plaquetas e fibrina. Freqüentes em artérias.
Vermelhos: constituídos basicamente de hemácias. Freqüentes em veias.

Mistos: são os mais comuns, contém todos os elementos do sangue e são formados por estratificações brancas alternadas com vermelhas.

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Os trombos das veias periféricas apresentam-se divididos em 3 partes:

Cabeça: branca geralmente pequena, responsável pela aderência.

Colo: porção estreita intermediária, na qual se alternam zonas brancas e vermelhas. As camadas alternadas são chamadas estrias de ZAHN.

Corpo: representando pela maior parte do tronco.

TROMBOS OCLUSIVOS, PARIETAIS E SÉPTICOS

Etiopatogênese

1. Pós operatório, baixa velocidade do sangue

2. Uso prolongado de anticoncepcionais libera fator de agregação plaquetário

3. Obesidade e diabetes

4. Idade falta de exercícios físicos desenvolve a aterosclerose

OBs.: Esteróides androgênicos = Trombose = AVC, IAM.

Sistema Fibrinolítico

Esta associada à digestão do trombo, impedindo o crescimento.

Amolecimento Puriforme

É o amolecimento do trombo devido à liberação de substancia que digere proteína, libera o fator fibrinolítico.

Embolia

Def.: É a obstrução vascular provocada por corpos estranhos que se deslocam com o sangue. Esses corpos são denominados de êmbolos.

Trajetória dos trombos

· Embolia Direta:

· Embolia Cruzada:

· Embolia Retrógada:

Tipos de Embolo

ÊMBOLOS SÓLIDOS: trombóticos, tumorais, corpos estranhos que penetram a circulação etc.

ÊMBOLOS LÍQUIDOS: gordurosos

ÊMBOLOS GASOSOS:

1) Veias mantidas abertas durante cirurgias;

2) Traumatismos de cabeça;

3) Transfusões de sangue e injeções endovenosas;

4) Cateterização cardíaca;

5) Ruptura dos alvéolos pulmonares

Conseqüência dos êmbolos

Anóxia, hipóxia, infarto, necrose

Infarto

(do latim “in + fartu” - cheio)

Definição: é a necrose que se segue a anóxia ou hipóxia.

São divididos em 2 classes:

a) INFARTOS BRANCOS:

Podem ser formados em qualquer órgão sendo mais comuns nos rins coração e cérebro. “AMOLECIMENTO ENCEFÁLICO ´´. As hemorragias nessa área são restritas a zona periférica onde marcam transição entre necrose e tecido vivo. Etiopatogênese: oclusão do ramo arterial sem anastomoses suficientes.

b) INFARTOS VERMELHOS OU HEMORRÁGICOS:

Área de necrose por coagulação com hemorragia maciça que da coloração vermelha ao infarto. Comum em áreas endêmicas de Chagas. Tem a mesma forma do branco. É azulado ou vermelho escuro, rígido e saliente sobre a superfície do órgão.

Manifestações gerais do infarto

Febre, aumento da velocidade de hemossedimentação, leucocitose, elevação das enzimas plasmáticas (transaminases, DH, Fosfatases), aumento da bilirrubina.

Evolução dos Infartos

As mesmas da necrose.

Hemorragias

(gr. Haima = sg; rhegnymi = romper)

Definição: É à saída de sangue dos vasos sanguíneos ou do coração para o exterior, para o interstício ou para cavidades pré-formadas do organismo.

Classificação e nomenclatura

São classificadas em EXTERNAS OU INTERNAS.

Externas:

a) GASTRORRAGIA: hemorragia gástrica:

b) ENTERORRAGIA: hemorragia intestinal;

c) MELENA: fezes turvas, pastosas e fétidas pela presença de sangue alterado;

d) HEMATÊMESE: sangue parcialmente digerido;

e) OTORRAGIA. Hemorragia do conduto auditivo externo.

f) HEMOPTÁSE. Hemorragia proveniente dos pulmões;

g) EPISTAXE: hemorragia nasal

h) HEMATÚRIA: sangue urina

i) MENSTRUAÇÃO: sangue uterino periódico fisiológico que ocorre em cada ciclo menstrual;

Hiper menorragia - prolongada, profusa, cíclica

Amenorragia - ausência

Metrorragia - hemorragia uterina, anormal, acíclica

As hemorragias internas são formadas no interstício e recebem os seguintes nomes:

a) PETÉQUIAS: hemorragia minúscula na pele e mucosas;

b) EQUIMOSES: hemorragia maior nas peles e mucosas;

c) HEMATOMA: hemorragia na qual o sangue não se difunde no tecido formando acúmulo;

d) BOSSA SANGUÍNEA: coleção sangue localizada sobre o osso;

e) APOPLEXIA: hemorragia na intimidade do órgão ;

As hemorragias que ocorrem em cavidades pré-formadas são:

a) HEMOTÓRAX: cavidade pleural;

b) HEMOPERICÁRDIO: saco pericárdico;

c) HEMOPERITÔNIO: cavidade peritoneal;

d) H. VENTRICULAR E INTRAVENTRICULAR: ventrículos cerebrais;

Etiopatogênese

Podem ocorrer com ou sem solução de continuidade

Hemorragia com solução de continuidade: ruptura; erosão ou digestão da parede vascular (tuberculose, úlceras pépticas, etc.)

Hemorragia sem solução de continuidade: aumento da pressão intravascular como nas

DIÁSTASES HEMORRÁGICAS

Diástases são condições que favorecem hemorragias espontâneas ou em traumatismos devido a defeitos nas estruturas dos vasos sanguíneos.

Morfologia e Evolução

A coloração inicial é avermelhada/ violácea/ azulada/ esverdeada/ amarelada.

Os hematomas podem sofrer lise, reabsorção parcial, organização, encistamento, calcificação, ossificação.

HIGROMAS: encistamento.

Conseqüências

Depende dos seguintes fatores:

*Quantidade de sangue perdido;

· Rapidez da perda;

· Local da hemorragia;

Choque hipovolêmico; hemorragia no saco pericárdico e encéfalo; anemia etc.

Edema

( gr. Oidema = inchação)

Definição: acúmulo excessivo de líquidos no interstício ou cavidades pré-formadas do organismo. Também se denomina edema ao acúmulo de líquidos nos pulmões.

Tipos

HIDROTÓRAX

HIDROPERICÁRDIO

ASCITE, HIDROPERITÔNIO

HIDROCELE

Podem ser ainda:

TRANSUDATOS (aglutina)

EXSUDATOS (não aglutina)

Etiopatogênese

a) Redução da pressão oncótica das proteínas plasmáticas;

b) Permeabilidade vascular aumentada;

c) Alterações da drenagem linfática;

d) Alterações no interstício;

e) Retenção renal de sódio e água;

Morfologia

O órgão é volumoso, úmido, mole, brilhante, a pele se comprime por pressão digital. Ao microscópio notam-se espaços claros acidófilos devido a proteínas.

Conseqüências e evolução

Podemos ter edema de glote e edema pulmonar mas na maioria dos casos são reversíveis.

Congestão

Definição: acúmulo anormal de líquidos no interior dos vasos de um órgão ou de uma parte do corpo: trata-se geralmente de sangue mas pode ser bile, muco, plasma etc.

Estase

Definição: estagnação no organismo de líquidos como sangue ou outros líquidos orgânicos
como urina, muco, linfa etc.

Hipertensão arterial

Definição: É a elevação da pressão sistêmica sistólica e/ou diastólica.

Classificam em ESSENCIAL e MALÍGNA.

Hipertensão arterial essencial: forma familiar, genética da P. S. de causa desconhecida que pode acarretar anomalias anatômicas e fisiológicas no coração , rins ,e sistema nervoso.

Hipertensão arterial maligna: evolução fulminante e acelerada da H. essencial com papiledema, hemorragias retinianas, exsudatos, vasculopatias cardíaca e renal progressivas.

Mecanismos da Hipertensão Arterial

· Aumento da resistência vascular periférica;

· Sistema renina- angiotensina -aldosterona ;

· Fatores diversos: nutrição., sedentarismo, obesidade;

· Homestasia de Na;

Patologia

Esclerose arteriolar, hipertrofia ventricular esquerda, aterosclerose coronária, aneurismas, IAM, AVC etc.

Sinais e Sintomas

Tontura, cefaléia, epistaxe, rubor facial, fadiga

Insuficiência renal esquerda, papiledema, insuficiência cerebrovascular, IAM, AVC

DEGENERAÇÕES

Definição: São lesões celulares reversíveis decorrentes de alterações bioquímicas que resultam no acúmulo de substâncias no interior das células.

Lesão Celular

Reversível

o Degeneração aguda

o Degeneração crônica

Irreversível

o Necrose

Degeneração aguda: caracteriza-se por lesão citoplasmática cuja gravidade não é suficiente para causar necrose.

Degeneração crônica: caracteriza-se por acúmulo intracelular de diversas substâncias repetidamente podendo a lesão evoluir para necrose.

Substância Acumulada: constituinte celular normal; substância anormal; pigmento.

Classificação de LETTERER:

A) degenerações por acúmulo de água e eletrólitos;

B) “ “ “ “ proteínas

C) “ “ “ “ lipídeos;

D) “ “ “ “ carboidratos;

1. DEGENERAÇÃO HIDRÓPICA

Lesão celular reversível, caracterizada pelo acúmulo de água e eletrólitos no interior da célula tornando-a tumefeita.

SINONÍMIA: degeneração vacuolar; degeneração granula; tumefação turva; degeneração albuminosa.

ETIOPATOGENESE: retenção de Na; aumento da pressão osmótica
intracelular.

MORFOLOGIA: órgãos aumentam em peso volume; as células são mais salientes na superfície do corte, coloração parda. Células. Acidófilas com aspecto baloniforme.

EVOLUÇÃO E CONSEQUÊNCIA: não tem conseqüências sérias a não ser que sejam muito intensas.

2. DEGENERAÇÃO POR ACUMULO DE PROTEÍNAS

Hialina, D. Mucóide

· DEGENERAÇÃ HIALINA:

o Acúmulo de material acidófilo , vítreo no interior da célula.

Origem da proteína: material virótico, corpos apoptóticos, proteínas relacionadas à formação de corpúsculos; proteínas endocitadas.

Corpúsculos de Mallory: nos hepatócitos dos alcoólatras crônicos e são formados por filamentos de citoceratina e outras proteínas do citoesqueleto.

Corpúsculo de Russel: acúmulo excessivo de Ig no citoplasma dos plasmócitos.

· DEGENERAÇÃO MUCÓIDE:

o Hiperprodução de muco por células mucíparas;

o Hiperprodução de mucina em Adenoma e Adenocarcinoma;

o Transformação Mucóide em células do tecido conjuntivo;

3.DEGENERACÃO POR ACÚMULO DE LIPÍDEOS

Esteatoses ; lipidoses

· ESTEATOSES Deposição de glicerídeos no citoplasma de células que normalmente não os armazenam.

SINONÍMIA: degeneração gordurosa; infiltração gordurosa; metamorfose gordurosa;

ÓRGÃOS AFEETADOS: fígado, rins, coração.

Características MACROSCOPICAS: na esteatose grave ocorre o aumento do órgão afetado. Esse adquire coloração amarelada, perde elasticidade e consistência.

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS: técnica de preparação com parafina = imagem negativa.

Observação direta: Técnica do congelamento; Corantes específicos (SUDAM III, SUDAM NEGRO, TETRÓXIDO DE ÓSMIO).

Na ESTEATOSE o núcleo é deslocado para a periferia da célula ficando comprimido de encontro à membrana citoplasmática assumindo forma semilunar.

ETIOLOGIA: A lesão aparece todas as vezes que uma agressão interfere no metabolismo lipídico da célula, aumentando sua síntese, ou dificultando sua utilização transporte e excreção.

· Incremento da síntese; ingestão excessiva; excesso de ACETIL-COA.

· Redução da utilização de TG.

· Menor formação de lipoproteínas.

· Deficiente deslocamento e fusão das vesículas contendo lipoproteínas c/ membrana.

O agente lesivo pode ser : Hipóxia, desnutrição, agentes tóxicos.

EVOLUÇÃO, CONSEQUÊNCIAS E SIGNIFICADO CLÍNICO

É reversível, voltando ao normal em poucos dias.

LIPIDOSES

São acúmulos intracelulares de outros lipídeos que não triglicerídeos(TG). São representados por colesterol e seus ésteres e outros lipídeos complexos.

Podem ser:

LIPIDOSES ARTERIAIS / ATEROSCLEROSE: quando as gorduras se depositam nas paredes da artéria .

XANTOMATOSE: acúmulo de gorduras nos histiócitos devido à fagocitose.

5. Degeneração POR ACÚMULO DE CARBOIDRATOS

São pouco freqüentes e estão associadas a doenças metabólicas que favorecem o acúmulo de carboidratos ou seus metabólitos no interior da célula.

GLICOGENOSES: armazenamento excessivo de glicogênio em células do fígado, rins, músculos esqueléticos, e coração. Tem como causa a deficiência de enzimas que atuam na sua degradação. Deposita-se nos lisossomos ou no citosol.

MUCOPOLISSACARIDOSES: depósito anormal de poliglicanas ou proteoglicanas decorrente de doenças enzimáticas.

apostila 6 Microbiologia

Microbiologia
Professor: Giorgio
apostila 6

IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES

UROCULTURA

Os bastonetes Gram negativos são os principais microrganismos isolados no laboratório de Análises Clínicas, sendo encontrados causando principalmente infecções urinárias. Portanto, para efeito de estudo, será discutido neste texto a identificação destes microrganismos a partir da urina. As considerações, deve ser ressaltado, se não houver possibilidade de coletar a primeira urina do dia, o paciente deve coletá-la com no mínimo 3 horas após a última micção.

PRINCÍPIOS GERAIS:

A- CONTAGEM DE BACTÉRIAS NA URINA: Comparando os resultados de contagem de
bactérias na urina colhida com critérios de assepsia já mencionados com os quadros clínicos
dos pacientes, pode-se considerar o seguinte quadro interpretativo:

• 0-9.000 UFC/mL: sem significado clínico
• 10.000- 90.000 UFC/mL; suspeita de infecção Exame de resultado duvidoso. Dependendo do quadro clínico e das condições de coleta, deve ser repetido
• 100.000 UFC/mL ou mais: indício de infecção.

A associação Americana de Saúde Pública adota os seguintes critérios para indicar infecção. Pacientes que não estão sob medicação antimicrobiana.
Urina de jato médio: acima de 100.000
UFC/mL; colheita por sonda; acima de 10.000 UFC/mL
Pacientes sob medicação antimicrobiana:
Urina de jato médio acima de 10.000 UFC/mL e colheita por sonda: acima de 1.000 UFC/mL.
• Abaixo destas condições os germes não são identificados e nem é realizado o antibiograma.

B- IDENTIFICAR O GERME E RELACIONAR A CONTAGEM POR GERME ISOLADO:
A presença de 80.000 UFC/ mL, por exemplo, pode ser contaminação principalmente se for composta por mais de uma espécie.

C- NÃO SE DEVE CENTRIFUGAR A URINA ANTES DE REALIZAR AS INOCULAÇÕES
D- Para a cultura de urina deve-se utilizar o ágar sangue ou cled (para contagem total) e o teague ou Macconkey que é meio seletivo diferencial para flora Gram negativa.
A OMS preconiza o uso dos meios Teague ou MacConkey e ágar sangue, mas muitos laboratórios de Análises clínicas utilizam o ágar Cled ou Broiacin para a contagem.

Características do ágar cled: O meio é usado para a determinação do numero de germes, isolamento e identificação orientativa de microrganismos da urina. Este meio favorece o crescimento de praticamente todos os germes encontrados na urina. Devido à ampla disponibilidade de substâncias nutritivas e a sua carência de substâncias inibidoras e a possibilidade de se ter certa diferenciação das colônias. Como a substância lactose está presente, a sua degradação resulta na sensibilização do indicador azul de bromotimol para amarelo (pH ácido) e a cor azul indica a presença de substâncias alcalinas. A presença de colônias incolores indica microrganismos não fermentadores da lactose.
MÉTODOS DE TRIAGEM:

Apesar de atualmente estar comprovado que o único método de confiança é a cultura de urina com a contagem das bactérias, ainda alguns laboratórios utilizam métodos antigos ultrapassados que falham muito, especialmente se as contagens estão entre 10 000 e 90 000 UFC/mL.


PROVA DO NITRITO: A maioria das bactérias patogênicas para o trato urinário (todos os bastonetes Gram negativos fermentadores) reduz nitrato a nitrito.
Incuba-se a urina com nitrato a 37°C por 4 horas.
B- MICROSCOPIA: E feito um esfregaço a partir da urina e este é fixado e corado pelo método
de Gram. Estes esfregaços podem ser feito com o sedimento urinário após a centrifugação ou
com a urina sem centrifugar. Se realizado a partir do sedimento urinário e for observado mais
de 5 bactérias/campo, há mais de 100.000 UFC/mL de urina. Se realizado com a urina sem
centrifugar, deve-se encontrar mais de 1 bactéria/campo Este método tem pouca reprodutibilidade porque é muito difícil conseguir que os sedimentos urinários se fixem
uniformemente nas lâminas.

3- MÉTODOS DE CULTURA QUANTITATIVA:
INOCULO PADRONIZADO POR ALÇAS PADRONIZADAS:
Este método emprega alças calibradas que podem conter quantidade exata de urina: 0,01 mL ou 0,001 mL. A inoculação do material devera ser feita pela deposição de uma gota em um canto da placa espalhando-a em linha reta, no sentido de maior diâmetro. Posteriormente, com a mesma alça é realizada a confecção das estrias. O numero de colônias que cresceram em ágar sangue ou Cled, multiplicando pelo fator da alça utilizada representa o número de bactérias/ mL de urina semeada. A placa de Teague ou MacConkey serve para detectar os microrganismos Gram negativos e para identificá-los mais rapidamente?

CULTURA DE URINA EM LAMINA:
Alguns laboratórios de materiais para análises clínicas lançaram no mercado pequenos frascos esterilizados contendo uma lâmina com meio de cultura em sua superfície, destinados à cultura de urina. A lâmina é revestida com um ágar nutritivo de um lado e ágar MacConkey de outro Todos os métodos de identificação e antibiogramas podem ser realizados utilizando os microrganismos que cresceram na superfície destes meios. A lâmina é mergulhada na urina recentemente colhida, ficando as 2 superfícies completamente submersas. O excesso de urina é retirado sacudindo delicadamente a lâmina e em seguida, esta é recolocada no tubo e o mesmo é identificado e incubado a 37°C por 24 horas. Após a incubação, o crescimento na lâmina é comparado com o quadro referência que acompanha o produto O resultado é expresso em bactérias/mL de urina. Estes testes são úteis mas não dispensam o prosseguimento do estudo microbiológico e também são caros.

OBS: A contagem de colônias na urina também pode ser realizada pela técnica de pour plate mas esta técnica não é muito utilizada.


4- PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS: IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS OXIDASE NEGATIVAS SISTEMA DE IDENTIFICAÇÃO UTILIZADO: BAC-TRAY DIFCO
No decorrer dos últimos anos, cada vez mais o laboratório de Análises Clínicas tem isolado um número crescente de bactérias Gram negativas relacionadas às mais variadas patologias. Muitas opções têm sido oferecidas aos bioquímicos para facilitar a identificação bioquímica destes microrganismos. O sistema Bact-tray compõe-se de 3 conjuntos de provas bioquímicas. Duas se destinam a identificação de bactérias Gram negativas oxidase negativa (Enterobactéria ou não): Bact-tray l e II
O terceiro é utilizado para a identificação de bactérias Gram negativas oxidase positivas Cada conjunto possui 10 diferentes substratos contidos em um suporte de poliestireno descartável proporcionando rápida e fácil inoculação simultânea.
A identificação bacteriana esta baseada na obtenção de 3, 4 ou 7 algarismos derivados dos códigos das combinações bioquímicas obtidas.

PROCEDIMENTO:
A- Quando da necessidade da identificação de uma bactéria Gram negativa, realizar a prova da oxidase
Se for negativa: Bact-tray I e II
B- Todas as identificações neste método se baseia na utilização de um sistema de códigos e estes são obtidos pelas características bioquímicas inerentes a cada tipo de bactéria.

TÉCNICA PARA A UTILIZAÇÃO DO BACT-TRAY I E II:
A-MÉTODO DE INCUBAÇÃO NORMAL:
A.l- Suspender em 3 mL de água destilada estéril uma colônia de bactéria a ser identificada, de maneira a se obter uma turvação praticamente imperceptível.
OBS: inoculo com concentrações superiores podem induzir resultados insatisfatórios e preferencialmente utilize cultivo de 18-24 horas.
A.2- A suspensão acima deve ser bem homogênea.
A.3- Utilizando uma pipeta estéril, inocule 1,0 mL da suspensão a cada conjunto.
A.4- Adicionar 3 gotas de óleo mineral estéril às provas bioquímicas sublinhadas (ADH, LDC, ODC, H2S, URE)
A.5- Recoloque a tampa adesiva de maneira a se obter uma perfeita vedação e incube o tempo desejado, neste caso, 18-24 horas
A.6- Após a incubação, adicione 2 a 3 gotas dos reagentes necessários: alfa naftol e KOH no VP, cloreto férrico no PD e reativo de Kovacs no 1ND.
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS PROVAS BIOQUÍMICAS
A- PRODUÇÃO DO INDOL: (IND)
A metabolização do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase resulta na produção do indol formando um complexo de cor rosa ou vermelho com o reagente de Kovacs.
B- PROVA DO VOGES PROSKAUER (VP):
É um teste para a verificação de acetoína, que é um produto intermediário da degradação da glicose. Sua presença é indicada pela cor vermelha ou rósea, formada pela reação do complexo hidróxido de potássio e alfa naftol.
C- UTILIZAÇÃO DO CITRATO DE SÓDIO-CITRATO DE SIMMONS: (CIT)
Consiste na utilização do citrato de sódio como única fonte de carbono , o qual é quando metabolizado , resulta na produção de um produto alcalino de coloração azul ou verde azulado.

D- PRODUÇÃO DE H2S: GÁS SULFÍDRICO
O sulfeto de hidrogênio é produzido pela hidrólise enzimática do tiossulfato. Na presença de citrato férrico forma um precipitado negro.
E- ONPG:
A hidrólise da galactose pela beta galactosidase na presença do orto nitrofenol desenvolve cor amarela.

F- ARGININA DEHIDROLASE : (ADH)
Arginina dexidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
G- LISINA DESCARBOXILASE: (LDC)
Lisina descarboxilase transforma a Usina num composto básico de amina primária (cadaverina) e CO2. Esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
H- ORNITINA DESCARBOXILASE: (ODC)
Ornitina descarboxilase transforma a Ornitina em um composto básico de amina primária (putrescina) e CO2. Esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
I- UREIA: (URE)
-A uréase hidrolisa enzimaticamente a uréia com produção de amônia e CO2, produzindo cor vermelha.

J- FENILALANINA DESAMINASE: (PD)
A desaminação da fenilalanina produzida pelo ácido fenil pirúvico, forma uma cor verde na presença do "cloreto férrico.

CÁLCULO DO CÓDIGO PARA LANÇAMENTO NO MANUAL
1- Após a interpretação das provas bioquímicas assinale com um círculo as provas positivas. Estas possuem um valor numérico pré estabelecido.
2- Executa-se as somas conforme sua disposição, ou seja, 3 a 3, com exceção da última CIT que deve valer zero para a prova negativa e um para a prova positiva.
3- A soma anterior fornecerá um número de 4 algarismos
4- Este número é lançado no manual onde encontramos as probabilidades de identificação.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
É importante que sempre disponha de maiores informações que as fornecidas pelas reações bioquímicas tais como a origem do material clínico, morfologia da colônia, visando uma perfeita identificação final.

5- MEIO DE RUGAI COM LISINA:

Meio de cultura destinado a triagem bioquímica de Enterobactéria.
Este meio é composto na sua parte superior pelo meio de rugai, a parte central pela cera de Vascar (vaselina/carnaúba) e a parte inferior pelo meio de lisina-motilidade.
A inoculação é feita com auxílio de uma agulha bacteriológica através de picada profunda centrai até o fundo do tubo e estriada a superfície do meio de rugai. O meio é incubado a 37°C por 24 horas,

LEITURA E INTERPRETAÇÃO:
l- PARTE SUPERIOR: COR ORIGINAL: AZUL ESVERDEADA
lA- Ápice: Podem ser realizadas as seguintes leituras:
- Desaminação do triptofano: LTD. A reação positiva é caracterizada pela cor verde garrafa ou verde musgo quando o microrganismo é sacarose negativa ou cor marrom quando o microrganismo é sacarose positiva Fermentação da sacarose: Reação positiva: Amarela

l b- Base: Podem ser realizadas as seguintes provas:
- Fermentação da glicose: Reação positiva: cor amarela
- Produção de gás: Reação positiva: Formação de bolhas e ou arrebentamento do meio. Hidrólise da uréia: Reação positiva: cor azul intensa Produção de gás sulfídrico: Reação positiva: cor negra

2- PARTE INFERIOR: MEIO DE LISINA-MOTILIDADE: COR ORIGINAL: PÚRPURA
- Descarboxilação do L-lisina: Reação positiva:qualquer cor diferente de amarelo
- Motilidade: Reação positiva:crescimento além da área da picada e ou turvação do meio.

3-TAMPA- Possui papel de filtre
Pode ser realizada a leitura da prova do indol Adiciona-se l gota do reativo de Kovacs no papel de filtro existente na tampa. Reação positiva: cor vermelha.
OBS: as provas em destaque gráfico são típicas para o microrganismo em questão, ou úteis na
diferenciação de bactérias similares.
A prova de usina é falso positiva para proteus SP.
Esta tabela é válida somente para o meio de Rugai com lisina e este aspecto apresentado refere-se a
amostras de perfil bioquímico típico.
Outros fatores como procedência do material, resistência e antimicrobianos, sorologia e provas
bioquímicas adicionais podem ser necessárias para a identificação final do germe em questão.

PROCEDIMENTO PRÁTICO:
Verificar as características dos microrganismos Gram negativos no ágar MacConkey e no Teague: morfologia colonial, fermentação da lactose.
Verificar características dos microrganismos Gram positivos e Gram negativos e fermentadores da lactose no ágar Cled.
Inocular com alça calibrada de 10 µL a urina em placa de ágar cled e ágar MacConkey ou Teague. Incubar por 24hs e anotar características do crescimento no teague ou Macconkey e fazer a contagem das colônias no cled. Verificar se pela contagem o paciente está ou não com infecção, presumindo que a urina é de jato intermediário.
Fazer o método de coloração de Gram a partir da cultura em caldo
Fazer a leitura do crescimento no ágar Rugai modificado, observando as provas bioquímicas e fazer a identificação do microrganismo.
Fazer a leitura do bactray e Anotar os dados no gabarito e encontrar a espécie através do programa de computador instalado na central.

COPROCULTURA

1- MATERIAL CLÍNICO:
Fezes ou Swaps retais , dando preferência às fezes.

2- COLETA:
Deve ser coletada nos estágios iniciais da infecção antes de iniciar a antibioticoterapia
Coletar em recipientes estéreis com tampa justa e hermética
Processar o mais rápido possível, até 2 h após a coleta
Se não for possível processamento imediato, um swab deve ser utilizado Este deve coletar material fecal de vários pontos da amostra Se esta possuir sangue, muco, etc., estes devem ser coletados também . Este swab deverá ser conservado em meio de transporte em temperatura ambiente.
Se for encontrada a presença de pus, sangue deve-se fazer um esfregaço e corar pelo
Gram independente do pedido médico.

3- EXAME DIRETO:
Visa à procura de PMN fecais, parasitas, leveduras. A presença de leucócitos fecais é
indício de infecção bacteriana.

4- SEMEADURA DE ROTINA:
- Inocular em um meio de cultura de baixa seletividade (Teague ou MacConkey)
- Inocular em meio de cultura de seletividade moderada (XLD; ágar SS, Hektoen)
- Se necessário, inocular em caldo de enriquecimento (caldo selenito-cistina)
- Quando o médico suspeita de infecção por Campylobacter; Yersínia e Vibrio, o material deverá ser inoculado em meios específicos para o isolamento destes microrganismos.

5- IDENTIFICAÇÃO DOS PATÓGENOS ENTÉRICOS:
Quando nas fezes for encontrados patógenos pertencentes à espécie Escherichia coli, aos gêneros Salmonela e Sighella estas devem ser sorotipadas com anti-soros anti-H; anti-O, poli e monovalentes.
A presença de E. coli nas fezes só indica infecção se for encontrada uma das cepas patogênicas


TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DAS MICOSES.

As micoses, de uma maneira geral, têm assumido papel de destaque entre as enfermidades que afetam a saúde e o bem estar da população brasileira e isto se deve a fatores intrínsecos (diabetes, gravidez, fatores hormonais, etc.) e extrínsecos (uso de antibióticos por tempo prolongado, uso de anticoncepcionais. stress.etc.).
Os fungos estão incluídos no reino Fungi e são seres eucariotas que possuem parede celular de quitina, armazenam glicose na forma de glicogênio, não formam tecidos verdadeiros. São divididos cm 2 grandes grupos:
os bolores ou fungos filamentosos e as leveduras.
Somente os microfungos apresentam importância como agentes etiológicos de micoses estando distribuídos nas classes Deteromycetes, Ascomycetes, Zygomyceles c Endomyceies,
Os métodos de identificação fúngica seguem o mesmo ritual da identificação bacteriana: Exame direto (a fresco, após coloração ou histopatológico), cultivo em meios apropriados e provas bioquímicas.

ORIENTAÇÃO GERAL:
As micoses se dividem em superficiais, cutâneas, ceratomicoses, subcutâneas e profundas.
Para estudo microscópico da amostra, há 2 métodos:
A- Estudo microscópico de um fragmento da colônia entre lâmina e lamínula, geralmente com auxílio de um corante (lacto feno l azul algodão)
B-Cultivo em lâmina, também denominado de microcultivo, onde se utiliza placa de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro dobrado em U previamente esterilizado em forno de Pasteur. Coloca-se com todo cuidado de assepsia pequeno retângulo de Agar Sabouraud a 2% em camada fina sobre a lâmina. Com a alça de platina semeiam-se os lados do retângulo com o fungo a ser cultivado (fungos filamentosos). Coloca-se uma lamínula limpa e previamente tampada sobre o meio.
Adiciona-se na placa cujo fundo é protegido com papel de filtro, água destilada estéril para evitar o dessecamento do meio. liste conjunto é mantido à temperatura ambiente. Avaliamos o crescimento diariamente. Quando o crescimento é satisfatório, submetemos à ação do formol (0,5 m/ l hora); retiramos a lamínula, bem como o fragmento de meio de cultura. A lamínula e a lâmina são submetidas á ação de um fixador (álcool a 70%) e depois coradas com lactofenol azul algodão. Untamos com esmalte incolor.
Esta prova tem a utilidade de avaliarmos as estruturas de frutificação dos fungos que são preservadas por esta técnica, o que não acontece quando se retiram fragmentos da colônia.


CANDIDI ASES OU MONILÍASES:
A- COLETA E PREPARO DO MATERIAL:
O tipo de coleta e material varia de acordo com a manifestação clínica: raspados de pele ou unhas,
raspados das mucosas, escarro, sangue, líquor devem ser coletados em frascos estéreis quando se deseja realizar a cultura.

B- EXAME DIRETO:
Escamas de pele ou unha são colocadas entre lâmina e lamínula com KOH 10% e aquecidas ligeiramente.
Raspados de mucosas são visualizados sem necessidade de clarificação, utilizando coloração de Gram.
As leveduras do gênero Cândida apresentam-se como células ovais de paredes finas e granulantes. Podem
aparecer formas em pseudomicélio. Pelo exame direto não se diferenciam as formas patogênicas das
saprófitas.

C- TÉCNICAS DE CULTIVO:
A literatura descreve uma variedade de meios para isolamento e identificação das espécies de Cândida.
Mas o meio mais utilizado é o Agar Sabouraud com ou sem antibióticos. As culturas são incubadas a
temperatura ambiente ou a 37 graus. As colônias se desenvolvem em 3 a 4 dias e são cremosas de
coloração amarelada, lisas c com cheiro característico (fermento). Microscopicamente observaremos
células levedurifòrmes ovais e pseudomicelios.

D-IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES:
C. albicans é a espécie mais importante e sua característica principal é a produção de estruturas de
resistência denominadas clamidósporos. Pode-se completar o diagnóstico utilizando testes de fermentação
de açúcares denominado zimograma e assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (auxanograma)
assim como a produção de tubos germinativos.

E- PRODUÇÃO DE CLAMIDOSPOROS:
MATERIAL UTILIZADO: Placas de Petri. suporte para lâmina, lamínula, papel de filtro ou algodão hidrófilo, água destilada estéril, alça ou agulha de platina; Agar fubá-tween 80, pipetas Pasteur.
TECNICA: Fundir o meio de cultura e com pipeta verter pequena quantidade de Agar sobre a lâmina e deixar solidificar. Com a alça de platina, semear em estrias finas a levedura. Umedecer o papel de filtro ou algodão com a água destilada estéril. Incubar a Temperatura ambiente durante 4-5 dias. examinar ao microscópio.
LEITURA: Observar a presença e a disposição dos pseudomicelios, micélios verdadeiros (quando presentes) blastósporos globosos e clamidósporos abundantes terminais.
F- FORMAÇÃO DE TUBOS GERMINATIVOS:
inocular a levedura em 0,5 ml de soro de cavalo ou humano, incubar a 37 graus por 2-3 horas. Colocar em lâmina/lamínula e observar a presença de tubos germinativos.

MEIOS DE CULTURA PARA FUNGOS
1-AGAR SABOURAUD
Glicose......................................40g
Peptona...................................... lOg
Agar........................................... 15g
Água destilada.......................... l OOOmL
Aquecer a água, dissolver o Agar. Adicionar à glicose a peptona. Agitar. Autoclavar a 121C por 15 minutos

2- AGAR FUBÁ:
fubá..........................................40g
Agar............................................20g
Água destilada............................. 1000 mL
Cozinhe o fubá a água por 1 hora.
Filtre e leve o volume final para 1 OOOmL e adicione o Agar e funda e filtre novamente se necessário.
Adicione lOmL de tween 80 para cada litro. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

Microbiologia
Professor: Giorgio
apostila 5


NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA:

Serão estudados os cuidados básicos e essenciais para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados.

Técnica de semeadura:

Toda vez que se fizer uma semeadura é interessante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de culturas pêlos microrganismos ambientais

A) FLAMBAGEM DA ALÇA OU FIO DE PLATINA:

Tanto a alça como o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada de 2 a 3 vezes na chama. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45 graus em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material quer seja para a feitura de um esfregaço quer para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

B) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça de platina. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar o tampão de algodão. Flambar a alça após o uso.

C) As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para se evitar a contaminação dos germes do ar. Uma vez que as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

TÉCNICA DE PREPARO DE ESFREGAÇO

1- A PARTIR DE CULTURA EM MEIO SÓLIDO:
• Colocar 1 gota de solução fisiológica com alça de platina em uma lâmina limpa e desengordurada.
• Colher um pouco da cultura com alça de platina e emulsionar
• Espalhar sobre a lâmina de modo a formar uma delgada película.
• Deixar secar á temperatura ambiente
• Fixar pelo calor, passando o esfregaço 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen

2- A PARTIR DE CULTURA EM MEIO LÍQUIDO:

• Colher uma gota com alça de platina e espalhar sobre a lâmina
• Deixar secar á temperatura ambiente e fixar pelo calor

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM:
É um método de coloração diferencial desenvolvido pelo médico dinamarquês
Christian Gram em 1884.
• Corante primário: Cristal Violeta
• Mordente (auxiliar): Lugol
• Descorante ou agente diferenciador: álcool etanol 95%
• Corante secundário: Fucsina Princípio:
• O cristal violeta juntamente com o lugol dá origem a um complexo insolúvel, de coloração roxa denominado de complexo iodo pararosaanilina o qual se combina com o Rnam da membrana citoplasmática e da parede celular, sendo assim dificultada a sua remoção.

O álcool é uma substância desidratante e solvente de lipídeos. Assim, ao entrar em contato com a parede celular bacteriana, este solubiliza os lipídeos formando poros e, ao mesmo tempo, desidrata as proteínas fazendo com que estes poros fiquem menores.
Quando o álcool age em bactérias Gram negativas, formam-se grandes poros visto que estas bactérias possuem grande concentração de lipídeos na constituição de suas parede celulares.
À ação desidratante do álcool não é suficiente para fechar os poros abertos fazendo com que o complexo iodo pararosaanilina seja removido e a bactéria então fica descorada.
Quando a ação é sobre a parede da bactéria Gram positiva, que possui baixos teores de lipídeos em sua parede, o álcool forma pequenos poros que se fecham mais facilmente pela ação desidratante do álcool e o complexo corado não é removido, deixando a bactéria corada de roxo. Após a ação do álcool, o esfregaço é corado com fucsina que fornece uma coloração vermelha ás bactérias Gram negativas e as Gram positivas permanecem roxas.
Técnica:
• Preparar esfregaço bacteriano segundo os preceitos técnicos
• Cobrir o esfregaço com cristal violeta e aguardar l minuto
• Escorrer o corante e lavar a lâmina em água corrente
• Cobrir o esfregaço com lugol e aguardar l minuto Escorrer o lugol e lavar a lâmina em água corrente
• Com a lâmina inclinada deixar cair etanol a 95% por tempo delicado Lavar a lâmina em água corrente
• Cobrir o esfregaço com fucsina ou safranina e aguardar 30 segundos Lavar a lâmina em água corrente
• Secar a lâmina ao ar livre e examiná-la ao microscópio óptico empregando objetiva de imersão (100vz)

Anotar os resultados: quantidade de células, morfologia, arranjo, etc. Interpretação:
Células coradas em roxo: bactérias Gram positivas
Células coradas em vermelho: bactérias Gram negativas

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE ZIHEL-NEELSEN- BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTENTES- BAAR
Os microrganismos pertencentes ao gênero Mycobacterium não se coram por técnicas comuns de coloração e só se coram por técnicas especiais como o método de Ziehl Neelsen.
A diferença primordial entre estes microrganismos e os demais é a presença de uma camada de cera, conhecida como cera D presente na parede celular, que dificulta a penetração de corantes
No método de Ziehl Neelsen, é utilizada a carbofucsina que tem a sua penetração facilitada pela presença do calor. Após a penetração deste corante, o mesmo não pode ser removido, mesmo que sejam utilizados métodos drásticos como o tratamento com soluções álcool-ácido. Por tal fato, estes microrganismos são denominados de bacilos alcoóis-ácidos resistentes.

Pesquisa de Mycobacteríum tuberculosis
Material clínico: escarro, lavado gástrico.
l - O esfregaço deve ser realizado com a parte purulenta do escarro.
2- Misturar partes iguais do escarro + NaOH 3-4%
3- Agitar mecanicamente 5-10 minutos e esperar tempo necessário para a fluidificação completa (20-30 minutos)
4- Centrifugar a 3.000 r.p.m. por 15 minutos
5- Suspender o sedimento em 1 mL de água destilada e neutralizar com HCl a 3-4% com 0, 004% de vermelho de fenol.
6- Preparar o esfregaço com 1 gota do material e prosseguir a técnica de preparo e fixação do esfregaço, segundo os preceitos técnicos



MÉTODO DE COLORAÇÃO:
CORANTE PRIMÁRIO: FUCSINA CARBÓLICA

A fucsina carbônica é um derivado fenólico que é solúvel em material lipídico da parede celular das micobactérias. A penetração deste corante é facilitada pela aplicação do calor o qual permite a passagem da fucsina carbólica através da camada lipídica (cera) em direção ao citoplasma. Após a aplicação do corante, a célula é corada em vermelho, as que possuem e as que não possuem cera.
AGENTE DIFERENCIADOR: ÁLCOOL-CLORÍDRICO
A aplicação da mistura de álcool etílico e ácido clorídrico promove a remoção do corante de todas as bactérias que não possuem a camada de cera que envolve a parede celular.
Os BAAR são resistentes à ação do álcool-ácido, mantendo a coloração vermelha.

CONTRA-CORANTE OU CORANTE DE CONTRASTE:
O azul de metileno é utilizado como reagente final para corar as células que perderam o corante primário durante a diferenciação. Os BAAR permanecem corados em vermelho e as outras bactérias e células coradas em azul.

TÉCNICA:
A) Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer a lâmina até a emissão de vapores durante 5 minutos. Não deixar ferver o corante.
B) Esgotar a lâmina e diferenciar com álcool-ácido (manter a lâmina inclinada e deixar cair à solução gota a gota até que não desprenda mais corante.
C) Lavar em água corrente
D) Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno. Esperar de 15-30 segundos
E) Lavar em água corrente e secar
F) Observar ao m.o. com objetiva de imersão.
Interpretação: BAAR corados em vermelho e os Demais bactérias: em azul



PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE.

Uma cultura bacteriana é constituída pelo crescimento de uma população em um determinado substrato.
Os meios de cultura podem ser classificados quanto ao estado físico como sólidos, semi-sólidos, bifásicos, líquidos.
A superfície dos meios sólidos oferece oportunidade de se formar colônias, facilitando assim as observações macroscópicas e o isolamento do microrganismo.
Uma colônia geralmente é o resultado da multiplicação de uma célula
Cultura Pura: proveniente do crescimento de uma única célula
Cultura axênica: Proveniente do crescimento a partir de várias células de uma mesma espécie.
Os meios de cultura são compostos por nutrientes fundamentais para o desenvolvimento dos microrganismos.
Meio seletivo: ágar sabouraud.
Meio diferencial: manitol salt ágar (bactérias que fermentam a manita tomam o meio amarelo e as que não fermentam, fica inalterado); ágar sangue.
Meio seletivo/ diferencial: teague (fermentadores e não fermentadores da lactose e inibe flora Gram positiva)
Meio complexo: ágar sangue, ágar chocolate.
Meio enriquecedor: ágar sangue, ágar soro.






PREPARO DE ALGUNS MEIOS DE CULTURA:
ÁGAR TEAGUE OU E.M B.
Peptona de casei na péptica..................10g
Lactose.................................................. .5g
Fosfato d i potássico................................2g
Agar........................................................13,5g
Eosina Y...................................................4g
Azul de metileno.....................................0,065g
Água destilada...................................... 1 000 m L
Aquecer com agitação até que o meio ferva. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Misturar freqüentemente e distribuir em placas.

CALDO NUTRIENTE

Extrato de carne...... 40g
Água destilada.... ...... 1000 mL
Dissolver os componentes em água destilada em banho-maria ou aquecer no microondas


ÁGAR SABOURAUD CULTIVO DE FUNGOS

Peptona ........................... 10g
Dextrose ..................... .....40g
Água destilada.................. 1 000 m L
Aquecer com agitação até que o meio ferva. Autoclavar a 121°C por 15 minutos.

CONTROLE DE QUALIDADE.
Colocar um lote do meio preparado em estufa a 37°C por 24 horas para verificar possível contaminação


ARMAZENAMENTO DOS MEIOS:

No laboratório de análises clínicas há a necessidade de se ter a mão uma quantidade satisfatória de meios de culturas frescos, de grande uso, como ágar sangue, ágar chocolate, meios de Teague. SS Sabouraud, mas também há a necessidade de se dispor de meios de menor uso, pois nunca se sabe o exame que vai ser necessário para atender a um novo pedido.
Após o seu preparo e esterilização, os meios devem ficar em temperatura ambiente até seu esfriamento e posteriormente, ser armazenado em geladeira, devidamente identificado (nome, data de fabricação) de uma forma clara a fim de que o mesmo um estranho possa identificá-lo.

TESTE DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE:

O bio indicador está em una ampola contendo caldo nutritivo açúcar e indicador de ph e esporos de um microrganismo não patogênico, Bacillus stearothermophilus.
A resistência térmica destes esporos é vencida após 1 5 minutos, quando aquecidos em vapor sob pressão a uma temperatura de 121 °C por 15 minutos. Em temperaturas menores e em tempo de exposição insuficiente os esporos poderão sobreviver.
As ampolas são colocadas na autoclave juntamente com o material a ser esterilizado. Apôs a autoclavação, o sucesso* do processo de esterilização e checado pela incubação das ampolas a temperatura de 60 °C por 48h Não havendo crescimento, houve esterilização não havendo crescimento não houve esterilização. O crescimento causa turvação e sensibilização do indicador de ph, mudando a coloração de roxo para amarelo.
Estéril ampola roxa Não estéril: ampola amarela e turva.




TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DOS MICRORGANISMOS EM MEIOS DE
CULTURA:
Quando inoculamos um microrganismo em um meio de cultura que contenha todos os requisitos nutritivos e fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia seu desenvolvimento passando por todas as fases de crescimento já estudadas. A fase logarítmica dá onde às colônias que podem ser visualizadas sem o auxílio de microscópio, sendo considerada uma característica macroscópica da bactéria. Cada espécie possui um tipo de morfologia colonial característica que devem ser analisadas: forma, tamanho, bordas, pigmentação, tamanho, etc.
Em um meio de cultura, quando observamos um único tipo de colônia, temos uma cultura pura e quando observamos mais de um tipo, temos uma cultura mista. Em microbiologia há vários tipos de técnicas de inoculação, onde algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para exames quantitativos

D) FLAMBAGEM DA ALÇA OU FIO DE PLATINA:

Tanto a alça como o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada de 2 a 3 vezes na chama. A posição correia para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45 graus em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material quer seja para a feitura de um esfregaço quer para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri
.
E) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este devera ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça de platina. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar o tampão de algodão.
Flambar a alça após o uso.

F) As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para se evitar a contaminação dos germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubas das emestufas com a tampa voltada para baixo.





TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA: TÉCNICA DO ESGOTAMENTO

Consiste em depositar sobre um ponto da superfície de um meto de cultura uma alíquota do material e depois espalhá-lo em 2 ou 3 setores por meio da alça de platina sem recarregá-la de maneira a obter quantidades progressivamente menores de material para permitir o desenvolvimento de colônias isoladas. O sucesso da inoculação depende:
• Grande número de estrias
• Não perfurar o meio de cultura
• Não voltar sobre a estria
• Tomar pequena quantidade de material para inocular.
A obtenção de colônias isoladas nos permite analisar as colônias e se encontrarmos colônias diferentes podemos separá-las, obtendo, assim uma cultura pura.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA:
POUR PLATE OU PLACA DERRAMADA:

Pode ser realizado com o objetivo de se obter colônias isoladas estudo qualitativo ou para realizar contagem de colônias em placa estudo quantitativo.
o Realizar diluições do cultivo bacteriano.
o Transferir 1 mL para a placa de Petri estéril



o Colocar 15 a 20 mL de ágar fundido
o Realizar movimentos circulares para que a cultura se misture perfeitamente com o meio
o Esperar solidificar e incubar
o
1. TÉCNICA DE INOCULAÇÃO POR SEMENTEIRA DE SUPERFÍCIE:

É realizada com “SWABS" contendo o inoculo do microrganismo sendo este espalhado por toda a superfície do meio de cultura sólido contido em placa de Petri

2. TÉCNICA DE SEMADURA EM MEIO SÓLIDO INCLINADO:
Inocular a cultura em meio inclinado fazendo estrias na superfície do ágar, utilizando a alça de platina.

3. TÉCNICA DE INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO INCLINADO PICADA PROFUNDA:
Inocular a cultura em meio sólido inclinado utilizando a agulha de platina. A inoculação deve ter profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma picada.

4. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO:
Inocular a cultura utilizando alça de platina.