apostila 6 Microbiologia

Microbiologia
Professor: Giorgio
apostila 6

IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES

UROCULTURA

Os bastonetes Gram negativos são os principais microrganismos isolados no laboratório de Análises Clínicas, sendo encontrados causando principalmente infecções urinárias. Portanto, para efeito de estudo, será discutido neste texto a identificação destes microrganismos a partir da urina. As considerações, deve ser ressaltado, se não houver possibilidade de coletar a primeira urina do dia, o paciente deve coletá-la com no mínimo 3 horas após a última micção.

PRINCÍPIOS GERAIS:

A- CONTAGEM DE BACTÉRIAS NA URINA: Comparando os resultados de contagem de
bactérias na urina colhida com critérios de assepsia já mencionados com os quadros clínicos
dos pacientes, pode-se considerar o seguinte quadro interpretativo:

• 0-9.000 UFC/mL: sem significado clínico
• 10.000- 90.000 UFC/mL; suspeita de infecção Exame de resultado duvidoso. Dependendo do quadro clínico e das condições de coleta, deve ser repetido
• 100.000 UFC/mL ou mais: indício de infecção.

A associação Americana de Saúde Pública adota os seguintes critérios para indicar infecção. Pacientes que não estão sob medicação antimicrobiana.
Urina de jato médio: acima de 100.000
UFC/mL; colheita por sonda; acima de 10.000 UFC/mL
Pacientes sob medicação antimicrobiana:
Urina de jato médio acima de 10.000 UFC/mL e colheita por sonda: acima de 1.000 UFC/mL.
• Abaixo destas condições os germes não são identificados e nem é realizado o antibiograma.

B- IDENTIFICAR O GERME E RELACIONAR A CONTAGEM POR GERME ISOLADO:
A presença de 80.000 UFC/ mL, por exemplo, pode ser contaminação principalmente se for composta por mais de uma espécie.

C- NÃO SE DEVE CENTRIFUGAR A URINA ANTES DE REALIZAR AS INOCULAÇÕES
D- Para a cultura de urina deve-se utilizar o ágar sangue ou cled (para contagem total) e o teague ou Macconkey que é meio seletivo diferencial para flora Gram negativa.
A OMS preconiza o uso dos meios Teague ou MacConkey e ágar sangue, mas muitos laboratórios de Análises clínicas utilizam o ágar Cled ou Broiacin para a contagem.

Características do ágar cled: O meio é usado para a determinação do numero de germes, isolamento e identificação orientativa de microrganismos da urina. Este meio favorece o crescimento de praticamente todos os germes encontrados na urina. Devido à ampla disponibilidade de substâncias nutritivas e a sua carência de substâncias inibidoras e a possibilidade de se ter certa diferenciação das colônias. Como a substância lactose está presente, a sua degradação resulta na sensibilização do indicador azul de bromotimol para amarelo (pH ácido) e a cor azul indica a presença de substâncias alcalinas. A presença de colônias incolores indica microrganismos não fermentadores da lactose.
MÉTODOS DE TRIAGEM:

Apesar de atualmente estar comprovado que o único método de confiança é a cultura de urina com a contagem das bactérias, ainda alguns laboratórios utilizam métodos antigos ultrapassados que falham muito, especialmente se as contagens estão entre 10 000 e 90 000 UFC/mL.


PROVA DO NITRITO: A maioria das bactérias patogênicas para o trato urinário (todos os bastonetes Gram negativos fermentadores) reduz nitrato a nitrito.
Incuba-se a urina com nitrato a 37°C por 4 horas.
B- MICROSCOPIA: E feito um esfregaço a partir da urina e este é fixado e corado pelo método
de Gram. Estes esfregaços podem ser feito com o sedimento urinário após a centrifugação ou
com a urina sem centrifugar. Se realizado a partir do sedimento urinário e for observado mais
de 5 bactérias/campo, há mais de 100.000 UFC/mL de urina. Se realizado com a urina sem
centrifugar, deve-se encontrar mais de 1 bactéria/campo Este método tem pouca reprodutibilidade porque é muito difícil conseguir que os sedimentos urinários se fixem
uniformemente nas lâminas.

3- MÉTODOS DE CULTURA QUANTITATIVA:
INOCULO PADRONIZADO POR ALÇAS PADRONIZADAS:
Este método emprega alças calibradas que podem conter quantidade exata de urina: 0,01 mL ou 0,001 mL. A inoculação do material devera ser feita pela deposição de uma gota em um canto da placa espalhando-a em linha reta, no sentido de maior diâmetro. Posteriormente, com a mesma alça é realizada a confecção das estrias. O numero de colônias que cresceram em ágar sangue ou Cled, multiplicando pelo fator da alça utilizada representa o número de bactérias/ mL de urina semeada. A placa de Teague ou MacConkey serve para detectar os microrganismos Gram negativos e para identificá-los mais rapidamente?

CULTURA DE URINA EM LAMINA:
Alguns laboratórios de materiais para análises clínicas lançaram no mercado pequenos frascos esterilizados contendo uma lâmina com meio de cultura em sua superfície, destinados à cultura de urina. A lâmina é revestida com um ágar nutritivo de um lado e ágar MacConkey de outro Todos os métodos de identificação e antibiogramas podem ser realizados utilizando os microrganismos que cresceram na superfície destes meios. A lâmina é mergulhada na urina recentemente colhida, ficando as 2 superfícies completamente submersas. O excesso de urina é retirado sacudindo delicadamente a lâmina e em seguida, esta é recolocada no tubo e o mesmo é identificado e incubado a 37°C por 24 horas. Após a incubação, o crescimento na lâmina é comparado com o quadro referência que acompanha o produto O resultado é expresso em bactérias/mL de urina. Estes testes são úteis mas não dispensam o prosseguimento do estudo microbiológico e também são caros.

OBS: A contagem de colônias na urina também pode ser realizada pela técnica de pour plate mas esta técnica não é muito utilizada.


4- PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS: IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS OXIDASE NEGATIVAS SISTEMA DE IDENTIFICAÇÃO UTILIZADO: BAC-TRAY DIFCO
No decorrer dos últimos anos, cada vez mais o laboratório de Análises Clínicas tem isolado um número crescente de bactérias Gram negativas relacionadas às mais variadas patologias. Muitas opções têm sido oferecidas aos bioquímicos para facilitar a identificação bioquímica destes microrganismos. O sistema Bact-tray compõe-se de 3 conjuntos de provas bioquímicas. Duas se destinam a identificação de bactérias Gram negativas oxidase negativa (Enterobactéria ou não): Bact-tray l e II
O terceiro é utilizado para a identificação de bactérias Gram negativas oxidase positivas Cada conjunto possui 10 diferentes substratos contidos em um suporte de poliestireno descartável proporcionando rápida e fácil inoculação simultânea.
A identificação bacteriana esta baseada na obtenção de 3, 4 ou 7 algarismos derivados dos códigos das combinações bioquímicas obtidas.

PROCEDIMENTO:
A- Quando da necessidade da identificação de uma bactéria Gram negativa, realizar a prova da oxidase
Se for negativa: Bact-tray I e II
B- Todas as identificações neste método se baseia na utilização de um sistema de códigos e estes são obtidos pelas características bioquímicas inerentes a cada tipo de bactéria.

TÉCNICA PARA A UTILIZAÇÃO DO BACT-TRAY I E II:
A-MÉTODO DE INCUBAÇÃO NORMAL:
A.l- Suspender em 3 mL de água destilada estéril uma colônia de bactéria a ser identificada, de maneira a se obter uma turvação praticamente imperceptível.
OBS: inoculo com concentrações superiores podem induzir resultados insatisfatórios e preferencialmente utilize cultivo de 18-24 horas.
A.2- A suspensão acima deve ser bem homogênea.
A.3- Utilizando uma pipeta estéril, inocule 1,0 mL da suspensão a cada conjunto.
A.4- Adicionar 3 gotas de óleo mineral estéril às provas bioquímicas sublinhadas (ADH, LDC, ODC, H2S, URE)
A.5- Recoloque a tampa adesiva de maneira a se obter uma perfeita vedação e incube o tempo desejado, neste caso, 18-24 horas
A.6- Após a incubação, adicione 2 a 3 gotas dos reagentes necessários: alfa naftol e KOH no VP, cloreto férrico no PD e reativo de Kovacs no 1ND.
LEITURA E INTERPRETAÇÃO DAS PROVAS BIOQUÍMICAS
A- PRODUÇÃO DO INDOL: (IND)
A metabolização do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase resulta na produção do indol formando um complexo de cor rosa ou vermelho com o reagente de Kovacs.
B- PROVA DO VOGES PROSKAUER (VP):
É um teste para a verificação de acetoína, que é um produto intermediário da degradação da glicose. Sua presença é indicada pela cor vermelha ou rósea, formada pela reação do complexo hidróxido de potássio e alfa naftol.
C- UTILIZAÇÃO DO CITRATO DE SÓDIO-CITRATO DE SIMMONS: (CIT)
Consiste na utilização do citrato de sódio como única fonte de carbono , o qual é quando metabolizado , resulta na produção de um produto alcalino de coloração azul ou verde azulado.

D- PRODUÇÃO DE H2S: GÁS SULFÍDRICO
O sulfeto de hidrogênio é produzido pela hidrólise enzimática do tiossulfato. Na presença de citrato férrico forma um precipitado negro.
E- ONPG:
A hidrólise da galactose pela beta galactosidase na presença do orto nitrofenol desenvolve cor amarela.

F- ARGININA DEHIDROLASE : (ADH)
Arginina dexidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
G- LISINA DESCARBOXILASE: (LDC)
Lisina descarboxilase transforma a Usina num composto básico de amina primária (cadaverina) e CO2. Esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
H- ORNITINA DESCARBOXILASE: (ODC)
Ornitina descarboxilase transforma a Ornitina em um composto básico de amina primária (putrescina) e CO2. Esta amina produz uma elevação do pH do sistema com a conseqüente mudança de cor do indicador de amarelo para púrpura.
I- UREIA: (URE)
-A uréase hidrolisa enzimaticamente a uréia com produção de amônia e CO2, produzindo cor vermelha.

J- FENILALANINA DESAMINASE: (PD)
A desaminação da fenilalanina produzida pelo ácido fenil pirúvico, forma uma cor verde na presença do "cloreto férrico.

CÁLCULO DO CÓDIGO PARA LANÇAMENTO NO MANUAL
1- Após a interpretação das provas bioquímicas assinale com um círculo as provas positivas. Estas possuem um valor numérico pré estabelecido.
2- Executa-se as somas conforme sua disposição, ou seja, 3 a 3, com exceção da última CIT que deve valer zero para a prova negativa e um para a prova positiva.
3- A soma anterior fornecerá um número de 4 algarismos
4- Este número é lançado no manual onde encontramos as probabilidades de identificação.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
É importante que sempre disponha de maiores informações que as fornecidas pelas reações bioquímicas tais como a origem do material clínico, morfologia da colônia, visando uma perfeita identificação final.

5- MEIO DE RUGAI COM LISINA:

Meio de cultura destinado a triagem bioquímica de Enterobactéria.
Este meio é composto na sua parte superior pelo meio de rugai, a parte central pela cera de Vascar (vaselina/carnaúba) e a parte inferior pelo meio de lisina-motilidade.
A inoculação é feita com auxílio de uma agulha bacteriológica através de picada profunda centrai até o fundo do tubo e estriada a superfície do meio de rugai. O meio é incubado a 37°C por 24 horas,

LEITURA E INTERPRETAÇÃO:
l- PARTE SUPERIOR: COR ORIGINAL: AZUL ESVERDEADA
lA- Ápice: Podem ser realizadas as seguintes leituras:
- Desaminação do triptofano: LTD. A reação positiva é caracterizada pela cor verde garrafa ou verde musgo quando o microrganismo é sacarose negativa ou cor marrom quando o microrganismo é sacarose positiva Fermentação da sacarose: Reação positiva: Amarela

l b- Base: Podem ser realizadas as seguintes provas:
- Fermentação da glicose: Reação positiva: cor amarela
- Produção de gás: Reação positiva: Formação de bolhas e ou arrebentamento do meio. Hidrólise da uréia: Reação positiva: cor azul intensa Produção de gás sulfídrico: Reação positiva: cor negra

2- PARTE INFERIOR: MEIO DE LISINA-MOTILIDADE: COR ORIGINAL: PÚRPURA
- Descarboxilação do L-lisina: Reação positiva:qualquer cor diferente de amarelo
- Motilidade: Reação positiva:crescimento além da área da picada e ou turvação do meio.

3-TAMPA- Possui papel de filtre
Pode ser realizada a leitura da prova do indol Adiciona-se l gota do reativo de Kovacs no papel de filtro existente na tampa. Reação positiva: cor vermelha.
OBS: as provas em destaque gráfico são típicas para o microrganismo em questão, ou úteis na
diferenciação de bactérias similares.
A prova de usina é falso positiva para proteus SP.
Esta tabela é válida somente para o meio de Rugai com lisina e este aspecto apresentado refere-se a
amostras de perfil bioquímico típico.
Outros fatores como procedência do material, resistência e antimicrobianos, sorologia e provas
bioquímicas adicionais podem ser necessárias para a identificação final do germe em questão.

PROCEDIMENTO PRÁTICO:
Verificar as características dos microrganismos Gram negativos no ágar MacConkey e no Teague: morfologia colonial, fermentação da lactose.
Verificar características dos microrganismos Gram positivos e Gram negativos e fermentadores da lactose no ágar Cled.
Inocular com alça calibrada de 10 µL a urina em placa de ágar cled e ágar MacConkey ou Teague. Incubar por 24hs e anotar características do crescimento no teague ou Macconkey e fazer a contagem das colônias no cled. Verificar se pela contagem o paciente está ou não com infecção, presumindo que a urina é de jato intermediário.
Fazer o método de coloração de Gram a partir da cultura em caldo
Fazer a leitura do crescimento no ágar Rugai modificado, observando as provas bioquímicas e fazer a identificação do microrganismo.
Fazer a leitura do bactray e Anotar os dados no gabarito e encontrar a espécie através do programa de computador instalado na central.

COPROCULTURA

1- MATERIAL CLÍNICO:
Fezes ou Swaps retais , dando preferência às fezes.

2- COLETA:
Deve ser coletada nos estágios iniciais da infecção antes de iniciar a antibioticoterapia
Coletar em recipientes estéreis com tampa justa e hermética
Processar o mais rápido possível, até 2 h após a coleta
Se não for possível processamento imediato, um swab deve ser utilizado Este deve coletar material fecal de vários pontos da amostra Se esta possuir sangue, muco, etc., estes devem ser coletados também . Este swab deverá ser conservado em meio de transporte em temperatura ambiente.
Se for encontrada a presença de pus, sangue deve-se fazer um esfregaço e corar pelo
Gram independente do pedido médico.

3- EXAME DIRETO:
Visa à procura de PMN fecais, parasitas, leveduras. A presença de leucócitos fecais é
indício de infecção bacteriana.

4- SEMEADURA DE ROTINA:
- Inocular em um meio de cultura de baixa seletividade (Teague ou MacConkey)
- Inocular em meio de cultura de seletividade moderada (XLD; ágar SS, Hektoen)
- Se necessário, inocular em caldo de enriquecimento (caldo selenito-cistina)
- Quando o médico suspeita de infecção por Campylobacter; Yersínia e Vibrio, o material deverá ser inoculado em meios específicos para o isolamento destes microrganismos.

5- IDENTIFICAÇÃO DOS PATÓGENOS ENTÉRICOS:
Quando nas fezes for encontrados patógenos pertencentes à espécie Escherichia coli, aos gêneros Salmonela e Sighella estas devem ser sorotipadas com anti-soros anti-H; anti-O, poli e monovalentes.
A presença de E. coli nas fezes só indica infecção se for encontrada uma das cepas patogênicas


TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DAS MICOSES.

As micoses, de uma maneira geral, têm assumido papel de destaque entre as enfermidades que afetam a saúde e o bem estar da população brasileira e isto se deve a fatores intrínsecos (diabetes, gravidez, fatores hormonais, etc.) e extrínsecos (uso de antibióticos por tempo prolongado, uso de anticoncepcionais. stress.etc.).
Os fungos estão incluídos no reino Fungi e são seres eucariotas que possuem parede celular de quitina, armazenam glicose na forma de glicogênio, não formam tecidos verdadeiros. São divididos cm 2 grandes grupos:
os bolores ou fungos filamentosos e as leveduras.
Somente os microfungos apresentam importância como agentes etiológicos de micoses estando distribuídos nas classes Deteromycetes, Ascomycetes, Zygomyceles c Endomyceies,
Os métodos de identificação fúngica seguem o mesmo ritual da identificação bacteriana: Exame direto (a fresco, após coloração ou histopatológico), cultivo em meios apropriados e provas bioquímicas.

ORIENTAÇÃO GERAL:
As micoses se dividem em superficiais, cutâneas, ceratomicoses, subcutâneas e profundas.
Para estudo microscópico da amostra, há 2 métodos:
A- Estudo microscópico de um fragmento da colônia entre lâmina e lamínula, geralmente com auxílio de um corante (lacto feno l azul algodão)
B-Cultivo em lâmina, também denominado de microcultivo, onde se utiliza placa de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro dobrado em U previamente esterilizado em forno de Pasteur. Coloca-se com todo cuidado de assepsia pequeno retângulo de Agar Sabouraud a 2% em camada fina sobre a lâmina. Com a alça de platina semeiam-se os lados do retângulo com o fungo a ser cultivado (fungos filamentosos). Coloca-se uma lamínula limpa e previamente tampada sobre o meio.
Adiciona-se na placa cujo fundo é protegido com papel de filtro, água destilada estéril para evitar o dessecamento do meio. liste conjunto é mantido à temperatura ambiente. Avaliamos o crescimento diariamente. Quando o crescimento é satisfatório, submetemos à ação do formol (0,5 m/ l hora); retiramos a lamínula, bem como o fragmento de meio de cultura. A lamínula e a lâmina são submetidas á ação de um fixador (álcool a 70%) e depois coradas com lactofenol azul algodão. Untamos com esmalte incolor.
Esta prova tem a utilidade de avaliarmos as estruturas de frutificação dos fungos que são preservadas por esta técnica, o que não acontece quando se retiram fragmentos da colônia.


CANDIDI ASES OU MONILÍASES:
A- COLETA E PREPARO DO MATERIAL:
O tipo de coleta e material varia de acordo com a manifestação clínica: raspados de pele ou unhas,
raspados das mucosas, escarro, sangue, líquor devem ser coletados em frascos estéreis quando se deseja realizar a cultura.

B- EXAME DIRETO:
Escamas de pele ou unha são colocadas entre lâmina e lamínula com KOH 10% e aquecidas ligeiramente.
Raspados de mucosas são visualizados sem necessidade de clarificação, utilizando coloração de Gram.
As leveduras do gênero Cândida apresentam-se como células ovais de paredes finas e granulantes. Podem
aparecer formas em pseudomicélio. Pelo exame direto não se diferenciam as formas patogênicas das
saprófitas.

C- TÉCNICAS DE CULTIVO:
A literatura descreve uma variedade de meios para isolamento e identificação das espécies de Cândida.
Mas o meio mais utilizado é o Agar Sabouraud com ou sem antibióticos. As culturas são incubadas a
temperatura ambiente ou a 37 graus. As colônias se desenvolvem em 3 a 4 dias e são cremosas de
coloração amarelada, lisas c com cheiro característico (fermento). Microscopicamente observaremos
células levedurifòrmes ovais e pseudomicelios.

D-IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES:
C. albicans é a espécie mais importante e sua característica principal é a produção de estruturas de
resistência denominadas clamidósporos. Pode-se completar o diagnóstico utilizando testes de fermentação
de açúcares denominado zimograma e assimilação de fontes de carbono e nitrogênio (auxanograma)
assim como a produção de tubos germinativos.

E- PRODUÇÃO DE CLAMIDOSPOROS:
MATERIAL UTILIZADO: Placas de Petri. suporte para lâmina, lamínula, papel de filtro ou algodão hidrófilo, água destilada estéril, alça ou agulha de platina; Agar fubá-tween 80, pipetas Pasteur.
TECNICA: Fundir o meio de cultura e com pipeta verter pequena quantidade de Agar sobre a lâmina e deixar solidificar. Com a alça de platina, semear em estrias finas a levedura. Umedecer o papel de filtro ou algodão com a água destilada estéril. Incubar a Temperatura ambiente durante 4-5 dias. examinar ao microscópio.
LEITURA: Observar a presença e a disposição dos pseudomicelios, micélios verdadeiros (quando presentes) blastósporos globosos e clamidósporos abundantes terminais.
F- FORMAÇÃO DE TUBOS GERMINATIVOS:
inocular a levedura em 0,5 ml de soro de cavalo ou humano, incubar a 37 graus por 2-3 horas. Colocar em lâmina/lamínula e observar a presença de tubos germinativos.

MEIOS DE CULTURA PARA FUNGOS
1-AGAR SABOURAUD
Glicose......................................40g
Peptona...................................... lOg
Agar........................................... 15g
Água destilada.......................... l OOOmL
Aquecer a água, dissolver o Agar. Adicionar à glicose a peptona. Agitar. Autoclavar a 121C por 15 minutos

2- AGAR FUBÁ:
fubá..........................................40g
Agar............................................20g
Água destilada............................. 1000 mL
Cozinhe o fubá a água por 1 hora.
Filtre e leve o volume final para 1 OOOmL e adicione o Agar e funda e filtre novamente se necessário.
Adicione lOmL de tween 80 para cada litro. Autoclavar a 121C por 15 minutos.