Microbiologia
Professor: Giorgio
apostila 5


NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA:

Serão estudados os cuidados básicos e essenciais para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados.

Técnica de semeadura:

Toda vez que se fizer uma semeadura é interessante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de culturas pêlos microrganismos ambientais

A) FLAMBAGEM DA ALÇA OU FIO DE PLATINA:

Tanto a alça como o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada de 2 a 3 vezes na chama. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45 graus em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material quer seja para a feitura de um esfregaço quer para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

B) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça de platina. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar o tampão de algodão. Flambar a alça após o uso.

C) As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para se evitar a contaminação dos germes do ar. Uma vez que as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

TÉCNICA DE PREPARO DE ESFREGAÇO

1- A PARTIR DE CULTURA EM MEIO SÓLIDO:
• Colocar 1 gota de solução fisiológica com alça de platina em uma lâmina limpa e desengordurada.
• Colher um pouco da cultura com alça de platina e emulsionar
• Espalhar sobre a lâmina de modo a formar uma delgada película.
• Deixar secar á temperatura ambiente
• Fixar pelo calor, passando o esfregaço 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen

2- A PARTIR DE CULTURA EM MEIO LÍQUIDO:

• Colher uma gota com alça de platina e espalhar sobre a lâmina
• Deixar secar á temperatura ambiente e fixar pelo calor

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM:
É um método de coloração diferencial desenvolvido pelo médico dinamarquês
Christian Gram em 1884.
• Corante primário: Cristal Violeta
• Mordente (auxiliar): Lugol
• Descorante ou agente diferenciador: álcool etanol 95%
• Corante secundário: Fucsina Princípio:
• O cristal violeta juntamente com o lugol dá origem a um complexo insolúvel, de coloração roxa denominado de complexo iodo pararosaanilina o qual se combina com o Rnam da membrana citoplasmática e da parede celular, sendo assim dificultada a sua remoção.

O álcool é uma substância desidratante e solvente de lipídeos. Assim, ao entrar em contato com a parede celular bacteriana, este solubiliza os lipídeos formando poros e, ao mesmo tempo, desidrata as proteínas fazendo com que estes poros fiquem menores.
Quando o álcool age em bactérias Gram negativas, formam-se grandes poros visto que estas bactérias possuem grande concentração de lipídeos na constituição de suas parede celulares.
À ação desidratante do álcool não é suficiente para fechar os poros abertos fazendo com que o complexo iodo pararosaanilina seja removido e a bactéria então fica descorada.
Quando a ação é sobre a parede da bactéria Gram positiva, que possui baixos teores de lipídeos em sua parede, o álcool forma pequenos poros que se fecham mais facilmente pela ação desidratante do álcool e o complexo corado não é removido, deixando a bactéria corada de roxo. Após a ação do álcool, o esfregaço é corado com fucsina que fornece uma coloração vermelha ás bactérias Gram negativas e as Gram positivas permanecem roxas.
Técnica:
• Preparar esfregaço bacteriano segundo os preceitos técnicos
• Cobrir o esfregaço com cristal violeta e aguardar l minuto
• Escorrer o corante e lavar a lâmina em água corrente
• Cobrir o esfregaço com lugol e aguardar l minuto Escorrer o lugol e lavar a lâmina em água corrente
• Com a lâmina inclinada deixar cair etanol a 95% por tempo delicado Lavar a lâmina em água corrente
• Cobrir o esfregaço com fucsina ou safranina e aguardar 30 segundos Lavar a lâmina em água corrente
• Secar a lâmina ao ar livre e examiná-la ao microscópio óptico empregando objetiva de imersão (100vz)

Anotar os resultados: quantidade de células, morfologia, arranjo, etc. Interpretação:
Células coradas em roxo: bactérias Gram positivas
Células coradas em vermelho: bactérias Gram negativas

MÉTODO DE COLORAÇÃO DE ZIHEL-NEELSEN- BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTENTES- BAAR
Os microrganismos pertencentes ao gênero Mycobacterium não se coram por técnicas comuns de coloração e só se coram por técnicas especiais como o método de Ziehl Neelsen.
A diferença primordial entre estes microrganismos e os demais é a presença de uma camada de cera, conhecida como cera D presente na parede celular, que dificulta a penetração de corantes
No método de Ziehl Neelsen, é utilizada a carbofucsina que tem a sua penetração facilitada pela presença do calor. Após a penetração deste corante, o mesmo não pode ser removido, mesmo que sejam utilizados métodos drásticos como o tratamento com soluções álcool-ácido. Por tal fato, estes microrganismos são denominados de bacilos alcoóis-ácidos resistentes.

Pesquisa de Mycobacteríum tuberculosis
Material clínico: escarro, lavado gástrico.
l - O esfregaço deve ser realizado com a parte purulenta do escarro.
2- Misturar partes iguais do escarro + NaOH 3-4%
3- Agitar mecanicamente 5-10 minutos e esperar tempo necessário para a fluidificação completa (20-30 minutos)
4- Centrifugar a 3.000 r.p.m. por 15 minutos
5- Suspender o sedimento em 1 mL de água destilada e neutralizar com HCl a 3-4% com 0, 004% de vermelho de fenol.
6- Preparar o esfregaço com 1 gota do material e prosseguir a técnica de preparo e fixação do esfregaço, segundo os preceitos técnicos



MÉTODO DE COLORAÇÃO:
CORANTE PRIMÁRIO: FUCSINA CARBÓLICA

A fucsina carbônica é um derivado fenólico que é solúvel em material lipídico da parede celular das micobactérias. A penetração deste corante é facilitada pela aplicação do calor o qual permite a passagem da fucsina carbólica através da camada lipídica (cera) em direção ao citoplasma. Após a aplicação do corante, a célula é corada em vermelho, as que possuem e as que não possuem cera.
AGENTE DIFERENCIADOR: ÁLCOOL-CLORÍDRICO
A aplicação da mistura de álcool etílico e ácido clorídrico promove a remoção do corante de todas as bactérias que não possuem a camada de cera que envolve a parede celular.
Os BAAR são resistentes à ação do álcool-ácido, mantendo a coloração vermelha.

CONTRA-CORANTE OU CORANTE DE CONTRASTE:
O azul de metileno é utilizado como reagente final para corar as células que perderam o corante primário durante a diferenciação. Os BAAR permanecem corados em vermelho e as outras bactérias e células coradas em azul.

TÉCNICA:
A) Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer a lâmina até a emissão de vapores durante 5 minutos. Não deixar ferver o corante.
B) Esgotar a lâmina e diferenciar com álcool-ácido (manter a lâmina inclinada e deixar cair à solução gota a gota até que não desprenda mais corante.
C) Lavar em água corrente
D) Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno. Esperar de 15-30 segundos
E) Lavar em água corrente e secar
F) Observar ao m.o. com objetiva de imersão.
Interpretação: BAAR corados em vermelho e os Demais bactérias: em azul



PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE.

Uma cultura bacteriana é constituída pelo crescimento de uma população em um determinado substrato.
Os meios de cultura podem ser classificados quanto ao estado físico como sólidos, semi-sólidos, bifásicos, líquidos.
A superfície dos meios sólidos oferece oportunidade de se formar colônias, facilitando assim as observações macroscópicas e o isolamento do microrganismo.
Uma colônia geralmente é o resultado da multiplicação de uma célula
Cultura Pura: proveniente do crescimento de uma única célula
Cultura axênica: Proveniente do crescimento a partir de várias células de uma mesma espécie.
Os meios de cultura são compostos por nutrientes fundamentais para o desenvolvimento dos microrganismos.
Meio seletivo: ágar sabouraud.
Meio diferencial: manitol salt ágar (bactérias que fermentam a manita tomam o meio amarelo e as que não fermentam, fica inalterado); ágar sangue.
Meio seletivo/ diferencial: teague (fermentadores e não fermentadores da lactose e inibe flora Gram positiva)
Meio complexo: ágar sangue, ágar chocolate.
Meio enriquecedor: ágar sangue, ágar soro.






PREPARO DE ALGUNS MEIOS DE CULTURA:
ÁGAR TEAGUE OU E.M B.
Peptona de casei na péptica..................10g
Lactose.................................................. .5g
Fosfato d i potássico................................2g
Agar........................................................13,5g
Eosina Y...................................................4g
Azul de metileno.....................................0,065g
Água destilada...................................... 1 000 m L
Aquecer com agitação até que o meio ferva. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Misturar freqüentemente e distribuir em placas.

CALDO NUTRIENTE

Extrato de carne...... 40g
Água destilada.... ...... 1000 mL
Dissolver os componentes em água destilada em banho-maria ou aquecer no microondas


ÁGAR SABOURAUD CULTIVO DE FUNGOS

Peptona ........................... 10g
Dextrose ..................... .....40g
Água destilada.................. 1 000 m L
Aquecer com agitação até que o meio ferva. Autoclavar a 121°C por 15 minutos.

CONTROLE DE QUALIDADE.
Colocar um lote do meio preparado em estufa a 37°C por 24 horas para verificar possível contaminação


ARMAZENAMENTO DOS MEIOS:

No laboratório de análises clínicas há a necessidade de se ter a mão uma quantidade satisfatória de meios de culturas frescos, de grande uso, como ágar sangue, ágar chocolate, meios de Teague. SS Sabouraud, mas também há a necessidade de se dispor de meios de menor uso, pois nunca se sabe o exame que vai ser necessário para atender a um novo pedido.
Após o seu preparo e esterilização, os meios devem ficar em temperatura ambiente até seu esfriamento e posteriormente, ser armazenado em geladeira, devidamente identificado (nome, data de fabricação) de uma forma clara a fim de que o mesmo um estranho possa identificá-lo.

TESTE DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE:

O bio indicador está em una ampola contendo caldo nutritivo açúcar e indicador de ph e esporos de um microrganismo não patogênico, Bacillus stearothermophilus.
A resistência térmica destes esporos é vencida após 1 5 minutos, quando aquecidos em vapor sob pressão a uma temperatura de 121 °C por 15 minutos. Em temperaturas menores e em tempo de exposição insuficiente os esporos poderão sobreviver.
As ampolas são colocadas na autoclave juntamente com o material a ser esterilizado. Apôs a autoclavação, o sucesso* do processo de esterilização e checado pela incubação das ampolas a temperatura de 60 °C por 48h Não havendo crescimento, houve esterilização não havendo crescimento não houve esterilização. O crescimento causa turvação e sensibilização do indicador de ph, mudando a coloração de roxo para amarelo.
Estéril ampola roxa Não estéril: ampola amarela e turva.




TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DOS MICRORGANISMOS EM MEIOS DE
CULTURA:
Quando inoculamos um microrganismo em um meio de cultura que contenha todos os requisitos nutritivos e fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia seu desenvolvimento passando por todas as fases de crescimento já estudadas. A fase logarítmica dá onde às colônias que podem ser visualizadas sem o auxílio de microscópio, sendo considerada uma característica macroscópica da bactéria. Cada espécie possui um tipo de morfologia colonial característica que devem ser analisadas: forma, tamanho, bordas, pigmentação, tamanho, etc.
Em um meio de cultura, quando observamos um único tipo de colônia, temos uma cultura pura e quando observamos mais de um tipo, temos uma cultura mista. Em microbiologia há vários tipos de técnicas de inoculação, onde algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para exames quantitativos

D) FLAMBAGEM DA ALÇA OU FIO DE PLATINA:

Tanto a alça como o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada de 2 a 3 vezes na chama. A posição correia para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45 graus em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material quer seja para a feitura de um esfregaço quer para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri
.
E) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este devera ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça de platina. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar o tampão de algodão.
Flambar a alça após o uso.

F) As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para se evitar a contaminação dos germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubas das emestufas com a tampa voltada para baixo.





TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA: TÉCNICA DO ESGOTAMENTO

Consiste em depositar sobre um ponto da superfície de um meto de cultura uma alíquota do material e depois espalhá-lo em 2 ou 3 setores por meio da alça de platina sem recarregá-la de maneira a obter quantidades progressivamente menores de material para permitir o desenvolvimento de colônias isoladas. O sucesso da inoculação depende:
• Grande número de estrias
• Não perfurar o meio de cultura
• Não voltar sobre a estria
• Tomar pequena quantidade de material para inocular.
A obtenção de colônias isoladas nos permite analisar as colônias e se encontrarmos colônias diferentes podemos separá-las, obtendo, assim uma cultura pura.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA:
POUR PLATE OU PLACA DERRAMADA:

Pode ser realizado com o objetivo de se obter colônias isoladas estudo qualitativo ou para realizar contagem de colônias em placa estudo quantitativo.
o Realizar diluições do cultivo bacteriano.
o Transferir 1 mL para a placa de Petri estéril



o Colocar 15 a 20 mL de ágar fundido
o Realizar movimentos circulares para que a cultura se misture perfeitamente com o meio
o Esperar solidificar e incubar
o
1. TÉCNICA DE INOCULAÇÃO POR SEMENTEIRA DE SUPERFÍCIE:

É realizada com “SWABS" contendo o inoculo do microrganismo sendo este espalhado por toda a superfície do meio de cultura sólido contido em placa de Petri

2. TÉCNICA DE SEMADURA EM MEIO SÓLIDO INCLINADO:
Inocular a cultura em meio inclinado fazendo estrias na superfície do ágar, utilizando a alça de platina.

3. TÉCNICA DE INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO INCLINADO PICADA PROFUNDA:
Inocular a cultura em meio sólido inclinado utilizando a agulha de platina. A inoculação deve ter profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma picada.

4. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO:
Inocular a cultura utilizando alça de platina.