Aula 3
Prof.: Giorgio A R
Morfologia Geral das Bactérias
As bactérias podem se apresentar em três tipos fundamentais: Cocos, Bacilos/Bastonetes e Vibriões.
Principais Métodos de Coloração
De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de metileno, cristal violeta, fucsina básica, etc.)
Dentre os métodos existentes, aqueles que mais importância apresenta dentro de um laboratório de Microbiologia são os métodos de GRAM e de ZIEHL-NEELSEN.
O método de GRAM baseia-se na fixação por determinadas bactérias do composto iodo-pararrosanilina formado pela violeta de genciana (cristal violeta) e o lugol, que não é removível pelo tratamento subseqüente com álcool etílico (ou mistura, em partes iguais, de etanol e acetona). Estas bactérias que fixam o composto supracitado denominaram "gram-positivas".
Em contrapartida, determinadas bactérias não fixam o composto e deixam-se descorar facilmente pela solução descorante, recebendo por isto o nome de "Gram-Negativas". Para visualizá-las, tratamos o esfregaço no final com safranina (ou fucsina de Ziehl diluída 1:10). As bactérias Gram-positivas apresentam-se roxas e as Gram-negativas vermelhas.
É sabido, como regra geral, que: os cocos, com exceção das Neisserias, são geralmente Gram (+) e os bastonetes, com exceção das corinebactérias, Listeria, Bacillus e clostrídios, são Gram (-).
Preparação do Esfregaço
A preparação de um esfregaço é necessária na maioria dos procedimentos laboratoriais, incluindo os de coloração. Tem como finalidade fixar a bactéria a uma lâmina de vidro, evitando que aquelas sejam perdidas durante o processo de coloração propriamente dito. O esfregaço pode ser preparado a partir de colônias crescidas em meios sólidos ou a partir de um meio líquido.
Abaixo estão listados os principais pontos envolvidos na preparação de um bom esfregaço bacteriano:
1. Coloque uma pequena parte de uma colônia bacteriana crescida em meio sólido (ou o correspondente a duas alças de um meio líquido) no centro de uma lâmina de vidro previamente limpa e desengordurada com álcool e totalmente seca;
2. Se estiver trabalhando com colônias isoladas a partir de um meio sólido, adicione uma gota (e somente uma gota) de água destilada estéril (ou salina estéril) sobre a lâmina. Se estiver usando bactérias inoculadas em meio líquido, não há necessidade de se adicionar a água ou a salina;
3. Com o auxílio de uma alça de inoculação, misture o espécime completamente com o diluente, espalhando-o por cerca de 2/3 da lâmina de vidro (não se esqueça que deve sobrar 1/3 da lâmina para a identificação do esfregaço);
4. Coloque a lâmina (que ainda está úmida) em um suporte e espere que ela seque por completo. O esfregaço agora está pronto para os procedimentos de coloração.
Método de Gram (Modificado por Hucker)
Reativos
Solução-mãe de cristal violeta
Cristal violeta (20g); Etanol 96°GL (l OOmL)
Solução-mãe de oxalato
Oxalato de amónio (l g); Água destilada (l OOmL)
Solução de trabalho:
diluir a solução-mãe de cristal violeta 1:10 com água destilada e misturar com 4 volumes da solução-mãe de oxalato. Conservar em frasco de vidro âmbar com tampa de rosca.
Solução de iodo
Cristais de iodo ressublimado (l g); lodeto de potássio (2g)
Dissolver completamente em 5mL de água destilada. Logo após adicionar: água destilada (240mL), solução de bicarbonato de sódio a 5% (60mL).
Misturar e conservar em frasco de vidro âmbar.
Descorante
Etanol 96°GL ou Etanol 96°GL (250mL) + Acetona P.A. (250mL)
Misturar e conservar em frasco de vidro com tampa de rosca.
Contra corante
Solução-mãe: Safranina O (2,5g); Etanol 96°GL (l OOmL)
Solução de trabalho: diluir a solução-mãe de safranina 1:5 ou 1:10 com água destilada. Conservar em frasco de vidro com tampa de rosca.
Procedimento de Coloração
Em uma lâmina, fazer um esfregaço homogêneo, delgado, deixá-lo secar e fixá-lo na chama do bico de Bunsen (tempo delicado para evitar a formação de estruturas bizarras).
1) corar por cerca de l minuto com solução de cristal violeta;
2) lavar com água corrente;
3) cobrir o esfregaço com solução de lugol por cerca de l minuto;
4) lavar com água corrente;
5) descorar tom etanol comercial (ou solução etanol + acetona 50% v/v) por tempo delicado (até que não mais escorra cristal violeta do esfregaço);
6) lavar com água corrente;
7)corar com safranina(ou fucsina de Ziehl diluída 1:10) por cerca de l minuto;
8) lavar com água corrente;
9) deixar secar. Após, observar em objetiva de imersão em óleo.
Dá-se preferência à safranina como contra corante, pois as bactérias Gram-negativas coram-se de vermelho claro. Quando usamos a fucsina de Ziehl diluída, estas mesmas bactérias apresentam-se com coloração vermelha intensa, podendo confundir o observador menos experiente, pois esta cor se aproxima muito mais do roxo no espectro de cor do que o vermelho.
Coloração de Contraste com Fucsina Fenicada para a Coloração de Gram Aplicada a Bactérias com Coloração Débil
Fucsina fenicada de Kinyoun:
Fucsina básica (4g); Fenol (8mL); Etanol 96°GL(20mL); Água destilada (l OO mL).
Dissolver a fucsina básica no álcool t adicionar a água lentamente. Fundir o fenol em banho-maria a 56°C e adicionar 8 mL à solução de fucsina, usando uma pipeta de vidro com pipetador automático ou dispositivo de segurança similar.
Diluir o corante l: 20 em água destilada (5 mL de fucsina fenicada e 95 mL de água destilada) e usar no lugar da safranina na coloração de Gram.
Os microorganismos que são corados debilmente (Legionella, Bordetella, etc) podem requerer 3 minutos de coloração com o corante de fundo (contracorante).
Método de Ziehl-Neelsen
O método de ZIEHL-NEELSEN baseia-se no fato da álcool-ácido resistência de determinadas bactérias (p. ex: Mycobacterium tuberctilosis), o que permite tratá-las com uma solução de fucsina fenicada a quente. Tais bactérias resistem ao tratamento posterior com uma solução de álcool+ ácido clorídrico (HC1 3% em etanol), mantendo se com a coloração inicial vermelha (Bacilos Álcool Ácido Resistentes ou BAAR), enquanto outras descoram-se e vão apresentar a coloração de fundo, normalmente feita com azul de metileno.
Procedimento de Coloração
Em lâmina nova, fazer um esfregaço homogêneo, delgado, e fixá-lo na chama do bico de Bunsen (tempo delicado para evitar a formação de estruturas bizarras).
1) cobrir o esfregaço com solução de fucsina de Ziehl, deixando agir por tempo delicado, aquecendo brandamente (evitando a fervura) até desprendimento de vapor (por cerca de 5 minutos);
2) descorar com solução de álcool-ácido por tempo delicado;
3) cobrir o esfregaço com azul de metileno por cerca de l minuto;
4) lavar em água corrente e deixar secar. Observar em objetiva de imersão em óleo.
Classificação das Bactérias
AERÓBIOS
1) Cocos
Gram-positivos: Staphylococcus, Strepiococcus
Gram-negativos: Neisseria
2) Bacilos
Gram-positivos, formadores de esporos: Bacillus
Gram-positivos, não formadores de esporos: Corynebacterium, Lisíería, Erysipelothrix, Lactobacillus. Actinomyces aeróbicos, Kurthia, Rothia.
Gram-negativos, fermentadores de glicose:
Citrobacter, Edwarsiella, Escheríchia, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Pantoea, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia .
Gram-negativos não fermentadores:
Acinetobacter, Alcaligenes, Eikenella, Flavobacterium, Kingella, Moraxella, Oligella, Pseudomonas.
Gram-negativos "miscelânea":
Aeromonas, Bordelella, Brucella, Campylobacter, Cardiobaclerium, Chromobacteriiun, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella. Pasteurella. Plesiomonas, Streptobacillus, Vibrio.
Gram-variáveis:
Gardnerella
Álcool-ácido resistentes:
Mycobacterium
Parcialmente álcool-ácido resistentes:
Nocardia
3) Espiroquetas
Borrelia, Treponema, Leptospira
ANAERÓBIOS
1) Cocos
Gram-positivos: Streptococcus anaeróbicos
Coprococcus, Péptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus.
Gram-negativos:
Acidoaminococcus, Megasphaera, Veillonella
2) Bacilos
Gram-positivos, f armadores de esporos:
Clostridium
Gram-positivos, não formadores de esporos:
Actinomyces anaeróbicos, Biftdobacierium, Eu-bacterium, Lactobacillus anaeróbicos, Propio-nibacterium.
Gram-negativos:
Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella
OUTROS
Chlamydia, Rickettsia, Mycoplasma
Categoria
Intracelular obrigatório
Rickettsia spp. Chlamydia spp.
Intracelular facultativo
Salmonella spp. Shigella spp. Legionella pneumophilia Escherichia coli enteroinvasora Neisseria spp. Mycobacterium spp. Lyslería monocylogenes Bordelella pertusís
Predominantemente extracelular
Mycoplasma spp. Pseudomonas aeruginosa E.coli enterotoxigênica Vibrio cholerae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haeniophilus influenzae Bacillus anthracis
Bibliografia:
Bacteriologia C.H.Pessoa e Silva; um texto ilustrado Ed. Eventos
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